如何规避酶联免疫实验中的加样陷阱

在酶联免疫吸附测定（ELISA）的整个流程中，加样是奠定实验成败的基石。这一步的任何微小失误，如标本处理不当、操作时间控制不均或试剂添加失误，都可能导致结果的巨大偏差，甚至使整板数据作废。本文将直击加样环节的常见问题，并提供精准、可行的解决策略。

第一类问题： 未经充分处理的血清或血浆标本被直接用于加样。其中残留的红细胞、纤维蛋白原或脂类物质会严重干扰抗原抗体反应，导致非特异性显色，背景值过高。
解决策略：建立标准化的标本处理流程（SOP）。
血清标本： 血液采集后，应在室温下自然静置1-2小时，待其充分凝固。随后，使用离心机以3000 rpm的转速离心15分钟，小心吸取上清液备用。
血浆标本： 必须使用含有相应抗凝剂的采血管。采血后，务必立即轻柔颠倒混匀5-10次，确保抗凝剂与血液充分混合。静置片刻后，同样以3000 rpm离心15分钟获取上清。
标本储存： 若标本在几日内检测，可密封保存于2-8℃；如需长期储存，则必须分装后置于-20℃或更低温度的低温冰箱，避免反复冻融。

第二类问题：时间不等效
问题表现： 手工操作时，一次性处理的酶标板过多，导致第一孔与最后一孔的加样时间间隔过长。在将所有板加完样再统一放入孵箱的过程中，先加样的孔已经提前开始了反应，尤其在室温较高时，板孔边缘的液体会率先蒸发，造成浓度变化，最终导致整板结果出现明显的“边缘效应”或趋势性偏差。
解决策略：保证所有反应孔的“同步性”。
核心原则：即加即孵。 样品或试剂添加完毕后，应立即将酶标板放入规定温度的孵箱中，最大限度缩短室温暴露时间。
应对策略：分批操作。 当样本数量巨大时，切忌“贪多求快”。合理的做法是根据自己的加样速度，以2-4块板为一批进行操作。完成一批后，立即放入孵箱，再开始下一批的处理。