​一、实验原理与核心目标

转基因小鼠是通过将外源基因（如目的基因或基因编辑元件）导入小鼠基因组中，使基因稳定遗传并表达的动物模型。其核心目标包括：

​基因功能研究：通过基因过表达或敲除，解析特定基因在生理或病理中的作用。
​疾病模型构建：模拟人类疾病（如肿瘤、代谢性疾病）的发病机制，用于药物筛选及治疗研究。
​基因治疗验证：评估基因编辑工具（如CRISPR-Cas9、转座子系统）的效率和安全性。
​二、实验材料与设备准备

​实验动物：
​供体鼠：4-6周龄健康雌鼠（推荐杂交F1代，因其胚胎耐受性强）。
​受体鼠（假孕母鼠）​：需与结扎公鼠交配，确认阴道栓后使用。
​结扎公鼠：通过手术阻断输精管，确保无生育能力。
​试剂与仪器：
​激素：孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（HCG），用于雌鼠超数排卵。
​显微注射系统：包含显微操作仪、持卵针和注射针（针头直径4-5μm）。
​胚胎培养液：M2液（操作液）和M16液（培养液），需覆盖矿物油防止蒸发。
​三、实验操作流程

​（一）超数排卵与受精卵采集

​激素处理：雌鼠腹腔注射PMSG（5U/只）和HCG（2.5-5U/只），间隔48小时，随后与正常公鼠交配。
​受精卵获取：
确认阴道栓后，剖杀雌鼠取出输卵管，用透明质酸酶分离受精卵。
筛选原核清晰的受精卵（通常在交配后13-18小时形成），置于CO₂培养箱（37℃, 5% CO₂）中培养至2细胞期。
​（二）外源基因导入

​显微注射法​（经典方法）：
将线性化DNA溶液（浓度1-2ng/μL）注入雄性原核（较大且易容纳外源DNA）。
确认原核膨大后，将存活胚胎移植至假孕母鼠输卵管。
​优势：直接整合，无需载体；缺点：整合位点随机，可能引起插入突变。
​转座子系统​（高效替代方案）：
构建携带目的基因的转座子质粒（如piggyBac或Sleeping Beauty），与转座酶mRNA共注射至受精卵。
​优点：整合效率高（达80%），支持大片段（≤8kb）插入；注意事项：需验证转座酶活性以避免长期表达风险。
​（三）胚胎移植与后代筛选

​移植操作：
麻醉假孕母鼠，将胚胎（10-15枚/侧）注入输卵管壶腹部。
术后观察母鼠体重变化，19-21天后分娩获得F0代小鼠。
​基因型鉴定：
​初筛：剪尾提取DNA，通过PCR检测外源基因整合。
​表达验证：Western blot或免疫组化分析目标蛋白表达水平。
​四、关键注意事项

​胚胎质量控制：
避免透明带破损，注射后淘汰形态异常的胚胎。
胚胎培养时间不宜超过2小时，防止体外发育停滞。
​实验动物管理：
结扎公鼠需定期验证无生育能力（连续交配无受孕）。
F0代小鼠需独立分笼饲养，因整合位点和拷贝数存在个体差异。
​技术优化点：
​注射体积控制：不超过细胞质体积的50%，避免细胞膜破裂。
​麻醉安全：使用1%戊巴比妥钠（0.01mL/g体重）腹腔注射，监测呼吸频率。
​五、应用案例与拓展方向

​疾病模型：
​肿瘤研究：过表达致癌基因（如KRAS突变体）构建自发肿瘤模型。
​代谢疾病：敲除胰岛素受体基因模拟Ⅱ型糖尿病。
​基因编辑技术验证：
利用CRISPR-Cas9构建条件性敲除小鼠，研究基因时空特异性功能。
​药物开发：
在转基因小鼠中测试靶向药物的疗效与毒性（如PD-1抑制剂）。
​六、常见问题与解决方案

​问题 ​原因与对策
受精卵存活率低 注射压力过大或DNA浓度过高；优化注射参数，使用纯度≥90%的DNA溶液。
F0代无外源基因表达 整合位点位于沉默区域；筛选多只F0鼠或改用组织特异性启动子。
胚胎移植后母鼠流产 操作损伤输卵管；改用经验丰富的操作人员，减少器械接触时间。