核糖核酸酶T1

1.一种简单的gRNA体外筛选方法
摘要：目的 探讨体外筛选效率较高的引导核糖核酸(guide ribonucleic acid,gRNA)的方法.方法 以家兔扭转蛋白2A(torsin family 2 member A,TOR2A)基因的gRNA设计和筛选为例,介绍gRNA简单的体外筛选方法.首先根据TOR2A基因的外显子序列在线设计gRNA,选择3条gRNA序列(也可更多),将其分别插入到T7启动子之后,体外转录gRNA并纯化备用.设计包含gRNA打靶序列的一对引物,以基因组DNA为模板进行PCR扩增并胶回收PCR产物.将gRNA,PCR产物和Cas9内切酶组成的体系进行酶切实验,琼脂糖电泳判定gRNA引导的酶切效率.结果 琼脂糖凝胶电泳结果显示第1条gRNA未能引导Cas9内切酶对含打靶位点的PCR产物进行DNA酶切,第2条gRNA(GCTTGTCCATCTCGTCGAAG)和第3条gRNA(TCTCTTCCTCTTCGACGAGA)引导Cas9进行了比较彻底的酶切,第2、3条gRNA可用于后续研究.结论 此体外筛选方法是一种简单、可行和实用的gRNA的体外筛选策略.
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